В 1960 году окончил Театральное училище им. Б. Щукина, после чего до 1966 года работал в Центральном детском театре под руководством Анатолия Эфроса. В 1968 году завершил обучение на режиссёрских курсах при Центральном телевидении Гостелерадио СССР, а в 1969 году начал работать на телевидении в ТО «Экран».
Златоустовский проявил себя в различных творческих направлениях. Как режиссёр, он работал над множеством проектов, включая киножурнал «Ералаш» (1970–1980) и «Фитиль» (1980–1990), а также снял несколько фильмов, среди которых «Колыбельная для мужчин» (1976) и «Пожар – не стихия» (1985).
Как актёр, Златоустовский запомнился ролью майора Гаврилова в фильме «Офицеры» (1971), а также исполнил песню «Вечный огонь» («От героев былых времён…»), ставшую символом этого фильма.
Кроме того, Владимир Борисович занимался написанием сценариев и песен для кино. Его авторство включает песню «Дай лапу, верный пёс!», звучащую в финальных титрах сериала «Возвращение Мухтара».
Скончался Владимир Златоустовский 8 июля 2019 года в Москве. Похоронен на Хованском кладбище.